Из исследований Гельригеля неизбежно вытекало, что неизвестный фактор, способствующий накоплению азота бобовыми, есть результат жизнедеятельности микроорганизмов, хотя сам Гельригель не экспериментировал с микроорганизмами.
Исследования Гельригеля объяснили многие непонятные явления, с которыми сталкивались исследователи при изучении азотного питания бобовых растений. Получило объяснение кажущееся противоречие исследований Буссенго. Стало очевидным, что выводы Буссенго имели значение только для стерильной почвы, так как в опытах Буссенго со стерильными почвами (удобренными лишь золой и изолированными даже от атмосферной пыли) не могло произойти заражения почв микроорганизмами и потому не наблюдалось симбиотического усвоения молекулярного азота бобовыми. В свете исследований Гельригеля стали понятными и результаты опытов Билля, утверждавшего, что растения обладают способностью фиксировать азот атмосферы. Постановка опытов Билля не исключала заражения почвы микроорганизмами, а следовательно, и фиксации азота атмосферы.
Изолирование бацилл в чистом виде
Химический анализ показывал прибыль азота во всех колбах, где происходило масляно-кислое брожение и где развивались эти бациллы. В тех колбах, где микроорганизмы не развивались, не наблюдалось ни масляно-кислого брожения, ни прибыли азота. Изолирование бацилл в чистом виде не удавалось Виноградскому до тех пор, пока он «следовал указаниям ряда экспериментаторов, считающих свободный доступ кислорода необходимым условием усвоения азота». Однако сходство микроорганизма с бациллами масляно-кислого брожения (выделение свободного водорода) навело Виноградского на мысль о принадлежности его к анаэробным бактериям, и только преграждение доступа кислорода при помощи сопутствующих культуре микроорганизмов, поглощающих кислород, и в дальнейшем создание строго анаэробных условий путем запаивания пробирок после откачивания из них воздуха и введения поглощающего кислород пирогаллола привело к выделению в чистой культуре азотфиксирующего анаэробного микроорганизма рода Clostridium; название вида Виноградский дал в честь основателя микробиологии Луи Пастера — pasteurianum. Виноградский привел полное описание морфологических, культуральных и физиологических свойств выделенного им анаэробного фиксатора. Он показал, что клостридиум способен образовывать из азота атмосферы и водорода воды аммиак, фиксируя 2,5—3,0 мг азота на 1 г использованного энергетического вещества.
Значение принципа специфичности клубеньковых бактерий
Наиболее детально обосновали значение принципа специфичности клубеньковых бактерий как таксономического признака Ф. Ноббе (1830—1922) и Л. Гильтнер (1862—1923) в 90-е годы XIX в. Применяя для заражения бобовых растений бактерии, выделенные из клубеньков разных бобовых растений, они показали, что ризобии, сходные морфологически, существенно различаются по другим биологическим свойствам. Так, клубеньковые бактерии семян гороха заражают растения вики и образуют несколько менее активные клубеньки на чечевице; у люцерны, зараженной ризобиями клевера, вообще не образуются клубеньки.
Все это свидетельствовало о наличии видовой дифференциации у клубеньковых бактерий и подтверждало мнение Гельригеля и Бейеринка о том, что разные бобовые растения в естественных условиях могут произвольно заражаться различными микроорганизмами. В более поздних работах Гильтнер показал, что такое заражение может происходить в пределах только родственных групп растений.